试剂配制和准备
1. DEPC水或RNase free水；
2. 75%乙醇（现配后预冷）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水：无水乙醇=1：3），然后放4℃备用。1.5mL DEPC水+4.5mL无水乙醇；
3. 异丙/醇：棕色瓶；
4. lv仿：棕色瓶；
5. Trizol：存放于4℃。
RNA抽提
1. 匀浆：在通风橱中往含有组织块的EP管中加入TRIzol和磁珠（组织100mg+1ml trizol +2颗研磨珠）。
2. 研磨：设置研磨时间和频率，一般卵巢组织为65HZ，120s；随后可以继续实验或者冻存在-80℃。
3. 轻柔颠倒混匀10下，室温孵育5min。
4. 在通风橱中加入lv仿1/5 trizol体积（0.2ml）。
5. 轻柔颠倒混匀15s，室温孵育2~3min。
6. 4℃下离心，12000g，15min；观察液体分层：底层—红色酚-lv仿相；中间层—粉红色的交界相；上层—无色液相，即RNA层。
7. RNA分离：用移液枪将上清转入新的1.5mlEP管中（预估上清的容积，大约500μL，调好移液枪），加入0.5ml（与样品上清等量）异丙醇，盖紧后颠倒混匀后室温静置10分钟。
8. 4℃下离心，12000g，15min；小心弃去上清（倒去管中液体，残留液体用枪头在管口吸掉液体），注意底部的乳白色沉淀物即为RNA。
9. 往沉淀中加1ml 75%的乙醇（用DEPC水或RNase free水现配，预冷），颠倒混匀洗涤RNA沉淀一次。
10. 4℃下离心，12000g，5min。
11. 用移液枪小心弃去上清（倒去管中液体，残留液体用枪头在管口吸掉液体），置于超净台上吹干10-15min，让乙醇挥发。注意：不能太干，肉眼观察管壁和管底见得到的液体消失后即可，此时RNA沉淀稍变透明。注意不能让RNA沉淀干燥。勿开紫外；室温吹干不可太长，RNA易降解。
12. 在管中加10~20ul DEPC水或RNase free水溶解，37℃水浴锅温水浴10min，使RNA溶解。
13. 测浓度评估提取的RNA质量：A260/280在1.8-2.0之间；A260/230在2.0左右；A260在0.1-1之间。
14. RNA的保存：提取的RNA保存于-80℃超低温冰箱中，最好立即反转录以cDNA形式保存于-20℃冰箱。
400-0918-500
