一、模板
1. 模板降解
1）尽量选择新鲜提取的模板进行 PCR 扩增，通过凝胶电泳检测模板的完整性，若降解严重需要重新制备模板；
2）模板避免反复冻融。
2. 模板中含有抑制 DNA 聚合酶活性的抑制剂
1）采用离心柱法提取核酸，纯化模板，消除抑制剂的干扰；
2）适当减少模板量，采用梯度稀释摸索最佳模板量；
3）选用抗逆性强的 DNA 聚合酶。
3. 模板量太低
1）适当增加模板量；
2）模板为 cDNA 时，选用目的基因表达量高的组织提取高质量 RNA 并选用基因克隆专用的反转录试剂盒得到的 cDNA 作为模板；
3）选用灵敏度高的 DNA 聚合酶。
4. 高 GC, 复杂模板
1）使用 PCR 添加剂（比如 DMSO，甜菜碱）或 GC enhancer，促进高 GC，复杂序列模板双链解离从而有利于引物退火和序列延伸；
2）增加变性时间或温度，使 DNA 双链解离；
3）选用适用于高 GC，复杂模板扩增的 DNA 聚合酶。
5. 长片段
1）确保模板的完整性；
2）选择适用于长片段扩增的 Taq DNA 聚合酶或者高保真 DNA 聚合酶；
3）在试剂盒说明书建议的延伸速度基础上适当延长延伸时间；
4）采用抑制热交错 PCR（Suppression Thermo-Interlaced PCR, STI PCR）策略。
二、引物
1. 引物降解
1）重新合成高质量引物，少量分装保存，防止多次冻融，避免长期置于冰箱冷藏部分。
2. 引物设计不合理
1）建议使用引物设计软件（比如 Primer premier 6, Oligo 7 等）设计并选取评分较高的引物；
2）确保引物和模板结合的特异性。
三、DNA 聚合酶及其他反应组分
1. DNA 聚合酶选择不合适
1）根据实验目的选择合适的 DNA 聚合酶，比如分子克隆实验中涉及到序列的高保真扩增，需要选择一款针对不同类型序列具有普适性的高保真酶。
2. DNA 聚合酶活力下降
1）检查试剂是否过期，按照说明书要求合理保存试剂。
3. 反应缓冲液体系与目的基因不匹配
1）不同目的 PCR 反应要求反应缓冲液中的镁离子、钾离子、铵离子、化学添加剂等成分浓度是不一样的，建议使用试剂盒中优化好的缓冲液体系。
四、反应条件
1. 退火温度不合适，影响引物与模板特异结合
1）使用引物设计软件建议的退火温度，退火温度一般比引物的 Tm 值低 5 ℃；
2）不同的试剂盐离子浓度不同，最佳的退火温度可能存在差异，建议以软件建议退火温度为中心设置温度梯度，来获得最佳退火温度；
3）设置降落 PCR（Step-down）反应程序。
2. 其他反应条件不合适
1）不同的 DNA 聚合酶试剂最佳反应条件是有差别的，选用试剂说明书建议的变性温度和时间，退火时间，延伸温度和速度，循环数。
400-0918-500
